Požiadavky na testovanie súprav ELISA

Urobte dobrý kontrast vo formálnom teste, mali by sa zobrať testovacie podmienky pozitívnej a negatívnej kontroly a vzorky, ktoré sa majú testovať, by sa mali urobiť v dvoch kópiách, aby sa zabezpečila presnosť výsledkov testu.

Niekedy je pozadie vyššie, čo naznačuje nešpecifickú reakciu, môže byť uzavreté ovčím sérom, králičím sérom alebo BSA.

Výber experimentálnych podmienok

V teste ELISA je dôležité vybrať rôzne experimentálne podmienky vrátane: (1) Voľba tuhých-fázových nosičov: Ako pevné-fázové nosiče možno použiť mnohé látky, ako je PVC, polystyrén, polyakrylamid a celulóza. Môže mať formu konkávnej platne, skúmavky, guľôčky atď. V súčasnosti sa bežne používa mať 40-jamkové polystyrénové konkávne platne.

Bez ohľadu na to, aký druh nosiča, pred použitím môže byť skríning: s rovnakým množstvom antigénu balenie je, za rovnakých experimentálnych podmienok reagovať, aby sa zistilo, či jeho farebné podanie reakcie je homogenita, podľa ktorej je dobrý adsorpčný výkon. (2) Balenie podľa výberu protilátky (alebo antigénu): protilátka (alebo antigén) adsorbovaná na povrchu tuhej{2}fázy nosiča, závažnosť požiadavky je lepšia, adsorpcia vo všeobecnosti vyžaduje PH medzi 9,0 až 9,6. Určitý vplyv má aj adsorpčná teplota, čas a množstvo bielkovín, zvyčajne viac ako 4 stupne C 18 až 24 hodín. Optimálnu koncentráciu proteínových balení je potrebné titrovať: po balení s rôznymi koncentráciami proteínov (0,1, 1,0 a 10 ug/ml atď.) sa pozorujú hodnoty OD pozitívnych vzoriek, keď sú ostatné testovacie podmienky rovnaké. Vyberte koncentráciu s najväčšou hodnotou OD a najnižším množstvom proteínu.

Pre väčšinu bielkovín je to zvyčajne 1 až 10 ug/ml. (3) Výber pracovnej koncentrácie enzýmom-značenej protilátky: po prvé, počiatočný účinok titrácie pomocou priamej metódy ELISA (pozri časť s enzýmom-značenou protilátkou).

Potom upravte ďalšie podmienky alebo použite „metódu štvorcového poľa“ (ostré balenie, referencia pre skúmanú vzorku a enzýmom -značené protilátky sú rôzne riedenia) vo formálnom experimentálnom systéme, ktorý presne titruje svoju pracovnú koncentráciu. (4) Výber bázy enzýmu a donoru vodíka: výber donoru vodíka je lacný, bezpečný, s jasnou farebnou-reakciou a sám je bezfarebný. Niektoré donory vodíka (napr. OPD a pod.) majú potenciálne karcinogénne účinky, treba dbať na ochranu. Podmienení ľudia by mali používať nekarcinogénne, vysoko citlivé donory vodíka, ako sú TMB a ABTS je v súčasnosti uspokojivejšími darcami vodíka. Po určitom čase pôsobenia by sa mali pridať silné kyseliny alebo zásady, aby sa reakcia zastavila. Obvykle je vhodná doba pôsobenia substrátu 10-30 minút. Kvapalina na použitie substrátu musí byť pripravená čerstvá, najmä ak sa pred použitím pridá H2O2.